Využití AAS s plamenovou a elektrotermickou atomizací k

VYUŽITÍ AAS S PLAMENOVOU A ELEKTROTERMICKOU ATOMIZACÍ K MÉNĚ OBVYKLÝM VYŠETŘENÍM KOVŮ A METALOIDŮ V PODMÍNKÁCH KLINICKÉ LABORATOŘE Jiří Kukačka FONS 2010 PARDUBICE 20.9.2010

KOVY a POLOKOVY LIDSKÉM ORGANIZMU

ƒ ƒ ƒ

ƒ ƒ ƒ

Makroprvky (makrobiogenní kovy a metaloidy) Jejích podíl na celkové hmotnosti organizmu > 0,005 %. Na, Ca, Mg, K. přijímáme je většinou v potravě v požadovaném množství větších než 100 mg/den Mikroprvky (mikrobiogenní kovy a metaloidy) Jejích podíl na celkové hmotnosti organizmu < 0,005 dostateční množství pro organizmus je menší než 100 mg/den

ESENCIÁLNÍ STOPOVÉ KOVY a METALOIDY

STOPOVÉ KOVY a METALOIDY s neznámou fyziologickou funkcí

TOXICKÉ KOVY a METALOIDY

KOVY a METALOIDY jako xenobiotika využívané v medicíně (léčiva a diagnostika)

KOVY a METALOIDY VOLBA BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU • dle vlastností analytické metody • podle charakteru metabolizmu prvku, akumulace • dle účelu vyšetření (toxikologické, farmakokinetické) • dle možné invazivity atd. NESRÁŽLIVÁ KREV, PLAZMA, SÉRUM MOČ, SBĚR MOČI za 24 hodin LIKVOR SPERMA, SEMINÁLNÍ TEKUTINA MATEŘSKÉ MLÉKO VLASY, NEHTY, MEKONIUM JATERNÍ TKÁŇ, TVRDÉ TKÁNĚ

•

KOVY a METALOIDY 1. Indikace k vyšetření – poruchy z nedostatku prvek

porucha

Fe

Anemie, infekce, tumory

F

Zubní kaz, osteoporóza

Co

Makrocytická anemie

Cu

Mikrocytická anemie, Wilsonova choroba, Menkesova choroba,

Mn

Deformace kostí a chrupavky, pokles tvorby protrombinu

Mo

Porucha xanthinoxidasy, hypourikémie

Se

Retardace růstu, kardiomyopatie, Keshanova choroba, poruchy osifikace, m. Kaschin-Beck

Zn

Dermatitidy, zhoršené hojení ran, růstová retardace, náklonnost k infekcím, průjmy, talasémie, hypogonadismus, rheumatitis, vypadávání vlasů

KOVY a POLOKOVY LIDSKÉM ORGANIZMU Vztah mezi tkáňovou koncentrací a příjmem esenciálního prvku

Biologická funkce

100 %

OPTIMUM

DEFICIT

Tkáňová koncentrace a příjem prvku

TOXICITA

KOVY a METALOIDY 2. Indikace k vyšetření – nadbytek prvku, intoxikace

K potvrzení diagnózy je nutno prokázat všechny tyto rysy intoxikace kovem: •zdroj intoxikace musí být evidentní

•u pacienta musí být přítomny klinické známky a projevy otravy •abnormální koncentrace toxinu musí být prokazatelná v některé ze tkání

Laboratorní vyšetření hraje nenahraditelnou úlohu v diferenciální diagnostice . V klinické praxi by mělo být indikováno vyšetření na některý z toxických kovů nebo metaloidů vždy u pacientů s:

•renálním onemocněním neznámého původu •bilaterální periferní neuropatií •náhlými změnami mentálních funkcí •akutnímu záněty nosní nebo krční sliznice •s předchozí historií intoxikace

Intoxikace olovem Terapie EDTA

700 MT

250

Pb

600

400 150 300 100

200

50

concentration (μM)

500

200

Lead

Metallothionein content (μM)

300

100

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 20 34 35

Time (d)

Stuchlíková H., Dvořák P., Remešová S., Procházka J., Kukačka J., et al. Závažná intoxikace olovem z keramické čajové konvice u desetileté dívky. Čes.-slov. Pediat 2006; 61 (12) : 692-696. Petrlova J., Blastik O., Prusa R., Kukacka J., et al. Using of electrochemical methods for studying of metallothionein content in the human blood serum of a patient poisoned by lead and treated by platinum.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2005 Dec;149(2):485-8.

Co je v benzínu, když ne olovo ? antidetonátor MMT metylcyklopentadienyltrikarbonylmangan

Mangan a „šílenství“ ƒ ƒ

1837 Couper poprvé popsal manganizmus u dělníku pyrolusitového mlýna Manganové šílenství – 40.- 50. léta doly v Chile:

fáze: malátnost, somnolence, apatie, emoční labilita, sexuální disfunkce, slabost, letargie, anorexie a bolesti hlavy 2) Fáze: zhoršená paměť a rozhodování, úzkost, halucinace (30-90 dní) 3) Fáze: progresivní bradikinezie, dystonie, paréza, poruchy chůze, třes (záměrný) , zhoršená koordinace, ztuhlost tváře Chronické expozice →manganizmus = psychiatrické onemocnění (locura manganica), připomíná schizofrenii (agresivní chování, emoční labilita, halucinace).

1)

Zdroje Mn intoxikace Parentrální expozice Úplná parenterá parenterální lní výživa (UPV) = velké riziko Mn intoxikace Obvyklá koncentrace Mn ve výživách 5,6-8,9 μg/l, standardní dávka není stále známá (0,1-2,2 mg), popsány případy intoxikací UPV vždy vyšší než 0,1 mg/den, zvláště nebezpečné u osob s jaterní insuficiencí Pacienti (n=10) s celkovou parenterální výživou bez suplementace manganem 0,9

(OCHRIP FN MOTOL 2005, doc. Drá Drábková bková)

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

1. měsíc

2. měsíc

3. měsíc

Zdroje manganu ƒ ƒ ƒ •

• ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ

VZDUCH průměrně 0,01-0,07 μg Mn/m3 ,garáže 0,25 μg Mn/m3 VODA sladkovodní 1-200 μg/L, mořská 2 μg/L, hygienický limit v ČR (ČSN 757111) 0.1 mg/L PŮDA 40-900 mg Mn/kg (Mn horniny nad 7000 mg) POTRAVA denní příjem 2- 6 mg Mn, vegeteriáni nad 11 mg, vyšší příjem pijáci čaje ! nejvíce ořechy (18-46 ppm), obiloviny (2,2-6,7 ppm), málo maso, mléko (0,2-0,5 ppm) VÝROBKY 1) MnCl2: baterie, veterinární suplementa 2) MnO2: sklo, baterie, zápalné bomby 3) MnSO4: keramika, fungicidy, nutriční dopňky 4) KMnO4: desinfekce, čištění kovů, odbarvovače,ochranné postřiky ovoce a rostlin 5) organokovové sloučeniny: antidetonanty (CMT, MMT), aditiva motorových olejů, fungicidy

Mn esencialita •Rodina Mn dependentních enzymů: argináza, glutaminsyntetáza, fosfoenolpyruvátdekarboxyláza, Mn-superoxiddizmutáza •Důležitý pro normální imunitní funkce, regulace krevní glukózy a buněčné energie, reprodukci, trávení, růst kostí, antioxidační procesy, srážení krve

Mn deficience •Dobře popsaná u zvířat, u lidí velmi vzácná, patobiochemicky irelevantní a klinicky nepostřehnutelná, většinou při generalizované malnutrici •Poruchy růstu, vývoje a formací kostí, skeletární deformace, neplodnost, abnormální glukózová tolerance, změny v lipidovém metabolizmu •Suboptimální Mn koncentrace pozorována u lidí s epilepsií, osteoporózou, exokrinní pankreatickou nedostatečností, na chronické hemodialýze, dětí s Perthesovou chorobou nebo fenylketonurií

Neurotoxicita

manganu

Časné projevy Mn neurotoxicity: bolesti hlavy, ochrnutí svalů, ztráta chuti, apatie, insomnie, ztráta libida až dystonie, hypokinezie, svalový třes Poškození dopaminergních neuronů v mozkových strukturách kontrolující pohyb U některých pacientů symptomy připomínající Parkinsonovu chorobu Distribuce Mn do CNS: převládá přívod mozk. kapilárami, méně CSF a čichovým nervem, přenos přes hematoencefalickou bariéru

Manganem vyvolaná neurotoxicita u uživatelů methamfetaminu N=39 uživatelů MTF (23 let – měsíc) + infekce HBV, HBC Koncentrace S-Mn:

3,03±1,92 µg/l Referenč eferenční interval :(0, (0,43– 43–0,76) 76) µg/l g/l

Experimentální podávání čistého

MTF (1g/kg/den) u potkanů potkanů skupina

Mn n

μg/l

Kontroly

12

3,6± 0,4

MTF

12

2,9± 0,3

Koncentrace Mn v pupečníkové krvi fyziologických a nezralých novorozenců

* *

40 35

μg/L

30

* P90%)

X Vysoká toxicita, vznik rezistence, problematická biologická dostupnost

20.let inovativního designu Pt komplexů A

X Snížení lability = snížení toxicity

Pt X

X = odštěpitelné skupiny (anionické)

A

A = aminový ligand (neodštěpitelný) Zvýšení stability = určuje tvorbu aduktu DNA-PK (=antitumorovou aktivitu)

20.let inovativního designu Pt komplexů

Komplexy (II) ↓ Komplexy (IV) Komplexy cis ↓ Komplexy trans

Mechanizmus účinku Pt komplexů

Inhibice replikace Inhibice transkripce Narušení buněčného cyklu Neadekvátní oprava DNA Buněčná smrt

Pt komplexy – osud v organizmu ƒ Spontánní chemické reakce (neenzymatické transformace) - mnoho degradačních produktů ƒ Ireverzibilní vazba na proteiny a nízkomolekulové nukleofily (methionin) – nejsou cytotoxické pro nádorovou buňku, ale přispívají k obecné toxicitě léku ƒ Vylučování močí, kovalentní vazba ve tkáních

Cisplatina Aplikace Sarkomy, některé karcinomy (malobuněčný plic, ovaria), lymfomy, germinální buněčné tumory, testikulární tumory

Vedlejší účinky Nefrotoxicita, neurotoxicita, silný emetogen, ototoxicita, alopecie

Karboplatina Aplikace Nádory hlavy a krku, karcinom plic, ovárií, neuroblastom, retinoblastom

Vedlejší účinky Nausea, zvracení, hematotoxicita (neutropenie, trombopenie)

Oxaliplatina Aplikace Kolorektální karcinom (kombinace FOLFOX)

Vedlejší účinky Periferní neuropatie, únava, nausea, zvracení, diarhea, neutropenie, ztráta vlasů

Nedaplatina+lobaplatina

Úskalí analytického stanovení a farmakokinetického monitorování ƒ Jaký biologický materiál ? ƒ Stanovovat elementární Pt ? Intaktní molekulu ? Profil degradačních produktů ? ƒ Jakou analytickou technologií ?

Úskalí analytického stanovení a farmakokinetického monitorování ƒ Rychlá tvorba velkého množství různě reaktivních intermediátů →stanovuje se Pt ƒ Rozlišení mezi biologicky dostupnou platinou a vázanou-farm. nedostupnou v krvi a plazmě → stanovujeme v ultrafiltrátu (popř. plazmě)

Úskalí analytického stanovení a farmakokinetického monitorování ƒ Dostupné analytické techniky v klinické laboratoři: ƒ ET-AAS ƒ HPLC-UV, MS ƒ ICPMS

ET-AAS pro stanovení Pt na UKBP VARIAN SpectrAA 220 Z

AAS

32

AAS – Grafitová pec a Ľvovova vložka Vyhřívaný grafitový atomizér

Příčně vyhřívaný grafitový atomizér

33

Terapeutické monitorování Pt komplexů PROČ ? vytvoření a optimalizace individuálního terapeutického konceptu = určení vhodné dávky a předcházení nežádoucím účinkům léčby JAK ? výpočet AUC (plocha pod křivkou koncentrace versus čas)

Zavedení TDM KARBOPLATINY u dětí se solidními tumory ve FN MOTOL (2007)

Koncentrace CPt v plazmě (mg/l)

30

Koncentrace karboplatiny v závislosti na čase u stejného pacienta v různých cyklech.

25

Celková dávka CPt byla vždy 187 mg.

20

1.cyklus 2.cyklus 3.cyklus

15 10 5 0

0

5

10

15

Čas od začátku dávkování (h)

20

25

30

Terapeutické monitorování Pt komplexů Co musí být známo a zohledněno pro správnou interpretaci ? ƒ Věk, pohlaví, tělesný povrch, dávka, doba infuze, terapeutický cyklus ƒ Biologický poločas Pt, Pt clearance, distribuční objem, akumulace, vazba na plazmatické proteiny, vazba na buněčné elementy, metabolizmus a biotransformace, eliminace močí a stolicí, farmakokinetika u specifických skupin pacientů (s renálními nebo hepatálními poruchami), interakce s jinými léčivy

Terapeutické monitorování Pt komplexů

Pt concentration (ug/L)

Aplikace karboplatiny perivitreálně a intravitreálně jako možnost léčby retinoblastomu 6000 5000 4000 POI30 group

3000

POI15 group

2000

Pt concentration (ug/L)

1000 0

9000

3

8

13

TII group

18 23 28 33 Hours after dose

38

7000 5000 3000 1000 0

2

4

6 8 Days after dose

10

12

14

43

48

STRONCIUM

Struktura stronciumranelátu

KONTROLY

Efekt podávání stronciumranelátu 2 roky v dávce 900 mg/kg/den na proximální tibii u potkana. Snímek ze statické kostní histomorfometrie, zvětšeno 10x, barvení von Kossa (Ammann et al.2006)

STRONCIUMRANELÁT

Vliv koncentrace stroncia ve vodě (20, 50 a 100 mg Sr/l) na růst salátu po 25 dnech kultivace.

Hladiny stroncia v krvi u léčené pacientky •Žena, 59 let, 45 kg, 153 cm – gracilní •Těžká osteoporóza , T skóre na krčku femuru -2,9, páteř s výraznou skoliózou – T skóre -2,9 •Funkce ledvin normální •3 roky terapie bisfosfonáty bez zlepšení •Změna terapie na stronciumranelát 2 g/den •Od začátku terapie monitorování koncentrace Sr v plazmě •Dyspeptické potíže, snížena dávka na 1 g/den

2g SrR/den

10000

Poloviční dávka

9000

8782

8000

150

7000 6000 4835

5000

100

4000

87,2

3196

3000

2297

0

50 837 31

52

0

4115

2008

2000 1000

3870

100

200

300

400

dny terapie

500

600

700

Odpad Sr močí za 24 hodin (mg)

Koncentrace Sr v plazmě (ug/L)

Hladiny stroncia v průběhu terapie stronciumranelátem