Caracterización de la resistencia a germicidas en cepas de Listeria

RESUMEN En la industria de alimentos una de las medidas para controlar la presencia de microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes es la desinfección química de equipo y superficies, y alimentos que son consumidos crudos. En un trabajo previo se aislaron cepas de L. monocytogenes en una fábrica que procesa espinaca precocida y congelada; estas cepas mostraron mayor resistencia a cloro y ácido peracético comparadas con las de colección. Actualmente los mecanismos de adaptación bacteriana a estrés químico han sido poco estudiados. El objetivo de este trabajo fue caracterizar fenotipicamente la resistencia a germicidas en cepas de L. monocytogenes aisladas de un proceso de producción de espinaca precocida y congelada. Empleando cinco cepas de L. monocytogenes aisladas de un proceso de producción de espinaca (denominadas L15, L18, F6, L26, L75) y cinco cepas de colección (Scott A, 101-M, V7, LCDC, 101-14) se evaluó su resistencia a hipoclorito de sodio (200 ppm) y ác. peracético (80 ppm). Cuadros de espinacas (5 x 5 cm) se inocularon (~8 log UFC/espinaca), se sometieron a secado y se expusieron a los germicidas (5 min.). Se seleccionaron las cepas que mostraron mayor y menor reducción en la población bacteriana. Para determinar la máxima concentración de cloro que pudiera tolerar la cepa más resistente, se realizaron exposiciones en buffer de fosfatos adicionado de hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones (10, 20 y 40 ppm) durante 30, 60 y 90 segundos. Las células sobrevivientes fueron expuestas nuevamente a cloro; este procedimiento se repitió cada tercer día en cinco ocasiones. La inducción de la resistencia a cloro se investigó de manera similar en espinacas (200 ppm/ 5 min.), láminas de acero inoxidable y N-rubber (20 ppm/ 1 min). Para conocer la resistencia de las cepas seleccionadas a hipoclorito de sodio a bajas concentraciones (~1.5 ppm, preparado en medio Evans) se indujo la adaptación mediante la exposición de éstas al germicida durante 150 min. a 22 y 30°C. Al final del almacenamiento se investigó la presencia de ADN plasmídico (metodología de lisis alcalina) en las células de L. monocytogenes y se hicieron preparaciones para observar mediante microscopia electrónica de transmisión el daño ocasionado a las células por efecto del germicida. La cepa L15 fue la más resistente y la Scott A la más sensible, mostrando reducciones de 1 y 2 log UFC/espinaca, respectivamente. La exposición consecutiva de células de L. monocytogenes (cepa L15) a concentraciones subletales de cloro en suspensión o materiales inertes, no mostró una tendencia clara que haga suponer un incremento en la resistencia. La cepa L15 expuesta a cloro en medio Evans redujo 5.86 y 3.70 log UFC/ml, después de la incubación a 22 y 30ºC, respectivamente En contraste, la cepa de referencia Scott A mostró reducciones mayores de 7.95 y 7.45 log UFC/ml a 22 y 30°C, respectivamente; la cepa L15 (P5

Productos lácteos no fermentados

2.5

Quesos

10

Carnes de res

38

Carne de cerdo

36

Carne de aves

15-80

Papas

21

Verduras crudas

44

Fuente: Lund et al., 1989.

8

2.2.1.1 Listeriosis

La enfermedad originada por la bacteria L. monocytogenes es conocida como listeriosis, zoonosis de baja morbilidad y alta letalidad, que puede ser transmitida por el consumo de alimentos contaminados. Los individuos que tienen mayor riesgo de adquirir esta enfermedad son aquellos en los cuales el sistema inmunológico se encuentra comprometido, como son ancianos, mujeres embarazadas, neonatos y personas que han recibido trasplantes de órganos (NACMCF, 1991). Cuando personas inmunológicamente competentes llegan a consumir alimentos contaminados con esta bacteria pueden o no manifestar gastroenteritis no invasiva autolimitada (FDA, 2008).

En infecciones severas se han reportado septicemia e infecciones del sistema nervioso central que pueden llevar a la muerte; estas enfermedades pueden iniciar con síntomas gastrointestinales tales como náuseas, vómito, diarrea, fiebre o dolor de cabeza (Farber, 1992). La listeriosis invasiva de baja incidencia se caracteriza por una alta letalidad, que va del 20 a 30% (Schlech, 1998; Wing y Gregory, 2000; FDA, 2008). La mayoría de los casos de listeriosis ocurren esporádicamente, es decir de forma aislada sin ningún patrón aparente. Sin embargo, en la actualidad se han incrementado los reportes de esta enfermedad (FDA, 2008).

Con la finalidad de reducir a niveles mínimos la contaminación microbiana de origen en alimentos y evitar el posterior desarrollo de estos en los alimentos es necesario aplicar medidas estrictas de higiene y control de la temperatura (Novak et al., 2003).

En 1967, Blenden y Szatalowicz informaron que en el periodo de 1933 a 1966 en los EE. UU. se reportaron 731 casos humanos de listeriosis entre los posibles vehículos del patógeno se encontraban alimentos como lechuga y otras verduras. En 1979 en Boston se presentó un brote de listeriosis, con un total de 23 pacientes afectados, en este los alimentos involucrados fueron: apio, jitomate y lechuga, los cuales anteriormente no había sido relacionados como vehículo de microorganismos patógenos (Schlech et al., 1983; Ho et al., 9

1986). En 1981 en las provincias Maritine (Prince Edward Island, Nova Scotia and New Brunswick) se reportó otro brote de listerosis en este se propuso que la col pudo haber sido vehículo del microorganismo (Schlech et al., 1983) .

2.3 Tratamientos de desinfección química aplicados a frutas y verduras

Para reducir el riesgo de enfermar por el consumo de alimentos minimamente procesados los cuales se ingieren sin un tratamiento térmico, es necesario generar información con el objetivo de mejorar la desinfección química actual (Seymour et al., 2002).

La selección del tipo de germicida químico, así como la concentración empleada depende del alimento sobre el cual se aplicará la desinfección, el empleo de agentes surfactantes y solventes así como la manipulación mecánica (como el cepillado), pueden reducir o eliminar la hidrofobicidad (material ceroso) presente en el exterior de las frutas y verduras favoreciendo la exposición de los microorganismos a los germicidas (Parish et al., 2003).

Los agentes germicidas generalmente dañan la membrana microbiana interfiriendo con el transporte activo a través de está lo que puede provocar pérdida total de la viabilidad de los microorganismos (Wang y Johnson, 1992; Oh y Marshall, 1993; Larson et al., 1996).

Los desinfectantes químicos utilizados actualmente son potencialmente tóxicos y no logran inactivar completamente a los microorganismos en productos frescos como frutas y verduras (Koseki y Itoh, 2001; Park et al., 2001). Idealmente un desinfectante debe ser efectivo en presencia de materia orgánica, no tóxico para las personas ni corrosivo para el equipo, estable durante su almacenamiento, sin olor, soluble en agua y lípidos, con tensión superficial baja lo cual les permitira la penetración en grietas y económico (Prescott, 2003). Entres los factores que influyen principalmente en la acción de los desinfectantes químicos se encuentran: la concentración, temperatura así

10

como el tipo de microorganismo que este siendo expuesto al germicida (Prescott, 2003).

2.3.1 Cloro

El cloro (hipoclorito de sodio) ha sido usado ampliamente para la desinfección de alimentos por varias décadas y es quizá el desinfectante más ampliamente usado en la industria alimenticia así como en los hogares (Walter y LaGrange, 1991; Cherry, 1999).

El principio activo del hipoclorito de sodio es el cloro, ya que al combinarse con agua forma ácido hipocloroso (HClO) y libera cloro molecular el cual es oxidante a pH neutro o ácido (Rojas y Guevara, 2000). Cl2 + H2O → HClO + Cl- + H+ Se piensa que el cloro oxida los grupos sulfihidrilos (SH) de las proteínas transformándolos en disulfuros (S-S), causando inactivación de enzimas o alterando la integridad de la membrana (Vignoli, 2008). También se ha propuesto que el mecanismo de acción del HOCl evita que se lleve a cabo la fosforilación oxidativa, pero hasta la fecha no se ha dilucidado un mecanismo de acción que explique completamente el efecto de este germicida en los microorganismos (Rutala, 1996; McDonnell y Russell, 1999).

En soluciones acuosas, el equilibrio entre el ácido hipocloroso (HClO) y el ion hipoclorito (OCl-) depende del pH de tal manera que la concentración de HClO incrementa cuando el pH decrece; si el pH de la solución se ajusta a un rango de 4-7 la proporción de HClO es mayor a 60%. Este reacciona con la materia orgánica perdiendo su efecto germicida. La máxima solubilidad del HClO en agua se obtiene a 4oC. La concentración de HClO también es afectada por la temperatura, luz, aire y algunos metales (Parish et al., 2003).

11

Actualmente para desinfectar frutas y verduras se utilizan soluciones de cloro en agua (50-200 ppm); sumergiendolas en estás se consigue reducir la cantidad de microorganismos hasta 2 log UFC/g (Beuchat, 1992; Brackett, 1992; Taormina y Beuchat, 1999).

Investigaciones reportadas por Nguyen-the y Carlin (1994) sugieren que la inactivación de L. monocytogenes en vegetales utilizando cloro es limitada debida a las características de la superficie de este tipo de alimentos. Mientras que Zhang y Farber (1996) demostraron que el tratamiento de lechuga rebanada y col con cloro (200 ppm) por 10 minutos reducen la población de L. monocytogenes en 1.7 y 1.2 log CFU/g, respectivamente. Escudero et al. (1999) obtuvieron resultados similares en lechuga picada e inoculada con Yersinia enterocolitica, la cual recibió un tratamiento con cloro (100 a 300 ppm) durante 10 minutos logrando reducir de 2 a 3 log de UFC/g.

2.3.2 Ácido peracético

El ácido peracético, o ácido peroxiacético, es una mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido acético (Parish et al., 2003). Se ha propuesto que el mecanismo de acción del ácido peracético es la desnaturalización de proteínas y enzimas, incrementando de esta forma la permeabilidad de la pared celular de las bacterias ocasionada por la oxidación de los enlaces sulfidrilo y bisulfuro de las proteínas presentes en la membrana (Lippincott et al., 2001).

La eficacia del ácido peracético para inactivar microorganismos patógenos para humanos ha sido probada en diversos materiales y alimentos. Por ejemplo, la desinfección de láminas de acero inoxidable en las cuales se en contraban bacterias como L. monocytogenes y Pseudomonas spp. formando parte de una biopelícula, soluciones de ácido peracético lograron reducciones mayores en la inactivaión de estas bacterias comparando con las reducciones obtenidas al emplear soluciones de cloro, quizá sea debido a que a diferencia del cloro el ácido peracético no es neutralizado por la materia orgánica (Fatemi y Frank, 1999). 12

Este germicida también se ha utilizado para desinfectar frutas y hortalizas. Cuando se aplicó ácido peracético (40 y 80 ppm) en la superficie de melón, se obtuvieron reducciones significativas en las poblaciones de Salmonella y E. coli O157:H7 (Park y Beuchat, 1999). En otro estudio se evaluó el efecto del ácido peracético sobre las bacterias mesófilas de la superficie de naranjas. Las poblaciones fueron reducidas en un 85%, después de lavarlas y cepillarlas con agua, para finalmente desinfectarlas por inmersión durante 15 segundos en ácido peracético (200 ppm). Las reducciones microbianas ocasionadas por arrastre mecánico (lavadas, cepilladas y sumergidas en agua) fue únicamente del 60% del total de la población (Winniczuk, 1994).

En ensalada de verduras mixta se redujo aproximadamente 100 veces la cuenta total de coliformes fecales después de la aplicación de tratamientos con ácido peracético (90 ppm) o utilizando cloro (100 ppm). Los resultados reportados para las desinfecciones realizadas en varias empresas son variables. Por ejemplo, sumergir jitomates en una mezcla de ácido peracético (60 ppm) y agentes surfactantes durante 2 minutos reduce la población de S. javiana, L. monocytogenes y E.coli O157:H7 por 96%, 99.96% y 99.5%, respectivamente, comparado con el tratamiento en agua estéril (Parish et al., 2003). Resultados similares fueron obtenidos con una mezcla de ácido peracético (40 ppm) y agentes surfactantes (Parish et al., 2003).

2.4 Estrés bacteriano

Durante la producción y procesamiento de alimentos las bacterias son sometidas a diferentes condiciones de estrés. Entre los tipos de estrés se encuentran la exposición a tratamientos térmicos, congelación, desecación, cambios en la presión osmótica, exposición a conservadores, detergentes y desinfectantes, entre otros. La capacidad de las bacterias para sobreponerse a un estado de estrés puede incrementarse si se exponen frecuentemente o por periodos de tiempo prolongados al agente causante del estrés (Yousef y Juneja, 2003). 13

Existen diferentes grados de estrés que se clasifican de acuerdo con el efecto que tiene sobre los microorganismos (Figura 1). En el estrés subletal no se presenta pérdida total de la viabilidad, sólo reduce o inhibe la tasa de desarrollo microbiano. El estrés letal generalmente causa pérdida de la viabilidad en los microorganismos (Yousef y Juneja, 2003).

A D A P T A C I Ó N

Adaptación a estrés Reparación Estado de equilibrio

Estrés ligero

Reparación de daño causado por estrés

Reparación Estado de estrés

Estrés moderado

A Reparación

Lesión

E S T R É S

Muerte

ESTADO FISIOLÓGICO Figura 1. Estado fisiológico de células que han sido sometidas a diferentes grados y tipos de estrés. Fuente: Yousef y Juneja, 2003.

2.4.1 Mecanismos de resistencia bacteriana a varios tipos de estrés

Los mecanismos de resistencia pueden ser clasificados como innatos o adquiridos (Russell, 1991).

2.4.1.1 Resistencia innata. Es una capacidad que se encuentra asociada con el propio microorganismo. Esta resistencia varía de acuerdo al género, especie o cepa del microorganismo bajo estudio. Los mecanismos de resistencia incluyen barreras que se encuentran en la membrana externa por 14

ejemplo en bacterias Gram negativas los ácidos teicoícos (polímero de glicerol o ribitol) y en bacterias Gram positivas el transporte de compuestos a través de la membrana los cuales pueden inactivar rutas metabólicas.

Los desinfectantes químicos generalmente no actúan sobre sitios específicos ni son selectivos, por lo que probablemente la resistencia sea ocasionada por características innatas como por ejemplo, la reducción en la permeabilidad de la membrana (Russell et al., 1997).

2.4.1.2 Resistencia adquirida. La adquisición de este tipo de resistencia es resultado de cambios genéticos en la célula microbiana a través de mutaciones o bien ganancia de material genético.

Los microorganismos pueden adaptarse a condiciones ambientales de estrés, como el producido por la exposición a sales, ácidos, temperaturas altas y bajas, especies reactivas de oxígeno (ROS), escazes de nutrientes entre otros, por medio de la expresión de genes (Hengge-Aronis, 2000; Costa y Moradas, 2001; Hecker y Völker, 2001).

Se ha especulado que la resistencia microbiana a germicidas químicos es generada de forma similar a la resistencia ocasionada por antibióticos; está última puede ocasionar inactivación o modificación enzimática evitando que se lleve a cabo el metabolismo, provocando disminución en el transporte a través de la membrana, o bien perdida de la integridad de está permitiendo la salida de los componentes celulares (Russell et al., 1997).

En respuesta a estados de estrés las células microbianas pueden:

a)

Producir proteínas que reparan el daño o bien protegen a los

microorganismos neutralizando a los agentes estresantes. b)

Reducir a un minímo la tasa metabólica o bien pasar a un estado

de inactividad celular (formación de esporas o entrar en estado viable-nocultivable).

15

c)

Generar mecanismos de evasión de los anticuerpos del

huésped. d)

Mutaciones adaptativas.

2.5 Detección de genes involucrados en la respuesta bacteriana a condiciones de estrés

Se ha reportado que ante condiciones de estrés, existen genes que desencadenan mecanismos, como el aumento de la síntesis de novo de proteínas que incrementan la resistencia a condiciones de estrés (Koonin et al., 2000). Estas proteínas de estrés comúnmente son llamadas “proteínas de choque térmico”. La comparación de los genomas de las cepas sensibles con las resistentes puede permitir conocer cuales son los genes involucrados en la respuesta a condiciones de estrés (Koonin et al., 2000).

Small et al. (2007) realizaron un estudio que permitió la comparación de tres tratamientos de desinfección con Pseudomonas aeruginosa realizados por separado después de la exposición a una concentración subletal de hipoclorito de sodio, ácido peracético y peróxido de hidrógeno. Los resultados mostraron que las bacterias incrementan la expresión de genes en diferente grado dependiendo del tipo de desinfectante al cual se exponga.

Se han realizado estudios de microarreglos para caracterizar molecularmente cómo se modifica el transcriptoma de las bacterias como el Bacillus subtilis (Hayashi et al., 2005), Staphylococcus aureus (Chang et al., 2006) y Streptococcus pneumoniae expuestas a tratamientos con peróxido de hidrógeno (Ulijasz et al., 2004).

2.5.1 Proteínas expresadas por las bacterias en condiciones de estrés

La síntesis de proteínas por los microorganismos en respuesta a condiciones de estrés pueden tener como objetivo reparar el daño o bien 16

neutralizar el efecto del agente estresante. Entre las proteínas que se sintetizan en respuesta a condiciones de estrés, se encuentran proteínas reguladoras (por ejemplo, σ32 en E. coli y σB en L. monocytogenes), chaperonas (por ejemplo, GroEL), proteasa dependiente de ATP (por ejemplo Lon), y proteínas encargadas de reparar daños en el ADN (por ejemplo UspA) (Rosen et al., 2002). La detección y caracterización de estas se ha logrado mediante electroforesis bidimensional (Rince et al., 2002).

2.6 Adaptación de L. monocytogenes a condiciones de estrés

Se ha reportado que L. monocytogenes se adapta a la exposición a diferentes tipos y grados de estrés como el osmótico, el térmico y el químico (Lou y Yousef, 1997). La tolerancia ante ácidos por L. monocytogenes ha sido demostrada por varios investigadores (Kroll y Patchett, 1992; Hill et al., 1995; Davis et al., 1996; Phan-Thanh et al., 2000). La resistencia de las bacterias a la acidez depende de varios factores como el tipo y la concentración del ácido al que se expongan y las condiciones ambientales previas. L. monocytogenes posee el gen σB, encargado de regular varios mecanismos en respuesta al estrés. Este gen es análogo al encontrado en B. subtilis que se asocia con la osmotolerancia (Becker et al., 1998). Se ha reportado en varias investigaciones que el incremento en la resistencia bacteriana puede incrementar la virulencia (Becker et al., 1998; Wiedmann et al., 1998; Hecker y Völker, 2001). Lou y Yousef (1997) reportaron que al exponer las células de L. monocytogenes a etanol (5% v/v), HCl (pH 4.5-5.0), H2O2 (500 ppm) o NaCl (7% w/v) adicionados a cultivos en fase exponencial durante una hora estos agentes provocaron una protección cruzada, ya que además de generar resistencia a los agentes expuestos, también mostraron resistencia a etanol (17.5% v/v), HCl (pH 3.5) y H2O2 (0.1%) y NaCl (25% w/v). Ravishankar et al. (2000) reportaron que la adaptación de las células de Listeria sp frente a ácidos genera protección cruzada contra la actividad del sistema

lactoperoxidasa.

concentraciones

crecientes

La de

exposición acidez 17

de

L.

incrementa

monocytogenes su

capacidad

a de

sobrevivencia en alimentos ácidos, por ejemplo durante la fermentación de la leche esta pude permanecer viable (Hill et al., 1995; Gahan et al., 1996). Juneja et al. (1998) reportaron que la resistencia que se genera en células de L. monocytogenes cuando es sometida a temperaturas crecientes es afectada por el pH, acidez y temperatura y tipo de sustrato en el que se encuentren.

2.7 Formación de biopelículas

Las biopelículas son organizaciones microbianas compuestas por microorganismos que se adhieren a las superficies gracias a la producción de exopolímeros compuestos de glicocálix (75%) (Costerton, 1999; Betancourt et al., 2004). Las estructuras superficiales de las bacterias (apéndices) incrementan la superficie de contacto favoreciendo de esta forma la adhesión. Por ejemplo: flagelos, fimbrias y pilis que presentan algunas bacterias (Lejeune, 2003).

Una biopelícula microbiana representa un mecanismo de supervivencia ya que proporciona protección a factores ambiéntales y frente a tratamientos de erradicación microbiana. Se ha propuesto que cuando los microorganismos se encuentran sometidos a circunstancias adversas incrementan su capacidad para formar biopelículas (Betancourt et al., 2004). Cuando los microorganismos forman parte de una biopelícula disminuyen su tasa metabólica, esto les proporciona menor susceptibilidad a los tratamientos aplicados (Stewart y Costerton, 2001); eventualmente los microorganismos que forman parte de una biopelícula pueden liberarse, desplazarse y depositarse en otros sitios (Watnik y Kolter, 2000).

Estas organizaciones poseen un sistema de canales que le permiten construir un vínculo con el medio externo y de esta forma realizar intercambio de nutrientes así como eliminar metabolitos de desecho las colonias organizadas e incluidas en el exopolimero forman una capa impermeable en donde sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie son afectados por las condiciones ambientales. Los microorganismos que forman 18

parte de esta estructura se encuentran comunicados a nivel bioquímico entre ellos por un mecanismo denominado quorum sensing, este involucra la regulación y expresión de genes específicos a través de moléculas de señalización que controlan la comunicación intercelular (Wirtanen y Sandholm, 1992; Betancourt et al., 2004).

Evitar la formación de biopelículas es de primordial importancia para las industrias que producen alimentos, para esto es necesario realizar un lavado correcto que incluya cepillado de las superficies, seguido de un tratamiento químico o físico de desinfección, de esta forma se logra reducir la incidencia de formación de biopelículas (Hoyle y Costerton, 1991); ya que la resistencia a germicidas de los microorganismos que forman parte de una biopelícula puede incrementar de 100 a 1000 veces comparada con su estado libre o plactónico (Hoyle y Costerton, 1991).

2.7.1 Etapas en la formación de biopelículas

Marshall et al. (1971) propusieron dos etapas para la formación de biopelículas microbianas. En la primera los microorganismos son atraídos hacia una superficie por medio de interacciones debiles como hidrofóbicas, electrostáticas y fuerzas de van der Waals; en esta etapa los microorganismos aun no han tenido contacto con la superficie por lo tanto es reversible. Está atracción es influida por la naturaleza de la superficie así como por las cargas superficiales de las bacterias (Hood y Zottola, 1995; Teixeira y Oliveira, 1999).

En la segunda etapa existe la producción de polisacáridos que se adhieren a las superficies formando una matriz la cual por medio de interacciones hidrofóbicas, dipolo-dipolo, iónicas, covalentes y puentes de hidrógeno. En esta etapa las células que forman parte de la estructura pueden multiplicarse formando microcolonias en el interior de las biopelículas (Christensen, 1989).

19

Notermans et al. (1991) plantearon una tercera etapa, donde ocurre adsorción de las células a la superficie con la consecuente consolidación de las interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals, fortaleciendo la estructura de la biopelícula (red de polisacáridos) incrementando el desarrollo y colonización de los microorganismos. Barros de Macedo (2000) sugiere que la capacidad de los microorganismos para adherirse a una superficie depende su carga eléctrica así como de la rugosidad de esté.

Las bacterias que forman parte de las biopelículas pueden ser cuantificadas siguiendo técnicas de raspado y posterior cuenta en placa (Ganesh y Anand, 1998). Otras técnicas para el monitoreo de la población microbiana que forma parte de una biopelícula incluyen la microscopia de epifluorescencia (Wirtanen y Sandholm, 1993), microscopía electrónica de barrido (Oh y Marshall, 1995; Farid et al., 1998) y microscopía confocal láser de barrido (Burnett et al., 2000).

2.7.2 Capacidad de L. monocytogenes para formar biopelículas

L. monocytogenes en escaséz de algunos carbohidratos como manosa y trialosa mostró incremento en su capacidad para adherirse en superficies abióticas. Jeong y Frank (1994) reportaron la formación de biopelículas a 10oC sobre superficies de acero inoxidable en conjunto con algunas especies de Flavobacterium.

En

varias

investigaciones

se

ha

reportado

que

L.

monocytogenes es capaz de adherirse a superficies de plástico, rubber, acero inoxidable y vidrio (Mafu et al., 1990; Hood et al., 1997; Sinde y Carballo, 2000; Stepanovic et al., 2004; Chae et al., 2006).

En varias investigaciones se ha observado que las bacterias al formar parte de una biopelícula sufre cambios en su fisiología celular mostrando disminución en su tasa metabólica comparada con su estado libre (Wilks et al., 2005; Azevedo et al., 2006; Wilks et al., 2006).

20

2.8 Espinaca

La espinaca es una verdura perteneciente a la familia Chenopodiaceae, especie Spinacea oleracea su nombre hace referencia a las espinas que presentan sus frutos maduros. En una primera fase de crecimiento esta planta forma una roseta de hojas de duración variable según condiciones climáticas y posteriormente emite el tallo. De las axilas de las hojas o directamente del cuello surgen tallos laterales que dan lugar a ramificaciones secundarias, en las que pueden desarrollarse flores (Cantwell y Reid, 1993). Existen plantas masculinas, femeninas e incluso hermafroditas. Su tallo es erecto de 30 cm a 1 m de longitud en este se sitúan las flores, sus hojas parte comestible presentan un color verde oscuro y brillante. Las flores masculinas se presentan agrupadas en número de 6-12 en las espigas, terminales o axiales estas son de color verde y están formadas por un periantio con 4-5 pétalos y 4 estambres. Las flores femeninas se reúnen en glomérulos axiales y están formadas por un periantio bi o tetradentado, con ovarios uniovulares, estilo único y estigma dividido en 3-5 segmentos (Cantwell y Reid, 1993).

Desarrolla en terrenos con una composición química equilibrada, que contenga materia orgánica y nitrógeno. Las condiciones óptimas de desarrollo para la espinaca son 0°C y 95-98% H.R.; está verdura, están compuestas en su mayor parte por agua contiene un porcentaje relativamente bajo de hidratos de carbono y grasas (Cantwell y Reid, 1993). Los grupos de vitaminas que encontramos son: E, A, C y B y alto contenido de folatos; también contienen calcio, potasio, hierro, magnesio, fósforo, yodo y sodio; son una buena fuente de fibra para el ser humano (PROFECO, 2009).

2.8.1 Espinaca precocida y congelada

Las espinacas precocidas y congeladas se definen como aquellas que han sido sometidas a un proceso térmico (temperatura que no modifique sus características sensoriales), seguido de un enfriamiento y posterior congelación de tal forma que el agua contenida en ellas se convierte en hielo. Una vez 21

recolectadas las verduras, se seleccionan y se lavan, eliminando las partes no comestibles y los restos de tierra y suciedad, posteriormente se someten al blanqueado o escaldado, que consiste en sumergirlas en agua hirviendo durante unos minutos y el doble de tiempo en agua bien helada (shock térmico) consiguiendo inactivar las enzimas que intervienen en las reacciones bioquímicas y a los microorganismos patógenos, gracias a este proceso conservan las características sensoriales del producto y se incrementa la vida de anaquel del producto (PROFECO, 2009). Para llevar a cabo la congelación de las espinacas después de ser enfriadas y secadas, se lleva a cabo la congelación rápida a temperatura inferior a -18°C conservando la textura, color, sabor y calidad. La congelación puede realizarse por dos métodos: a) congelación con nitrógeno líquido en donde la verdura se coloca en túneles que son enfriados con nitrógeno líquido; b) congelación a través de chorros de aire, el cual se encuentra a temperaturas inferiores a 0ºC. Una vez congeladas deben mantenerse a una temperatura de -18 ó -20°C, para asegurar su calidad sensorial y microbiológica no debe interrumpirse esta temperatura (PROFECO, 2009). El sector de las verduras congeladas ha cobrado importancia en el terreno de la exportación. México es el segundo proveedor de EE. UU. en el sector agroindustrial, según cifras del Consejo Nacional de la Industria Maquiladora de Exportación de las frutas y verduras congeladas que se consumen en los EE.UU. el 70% son maquiladas en México (PROFECO, 2009). En 2004 México exportó, principalmente a EE.UU., 554.5 millones de dólares de legumbres y frutas preparadas o en conserva, un incremento de 90% con respecto a la década anterior, de acuerdo con estadísticas del Banco de México y del Departamento de Comercio estadounidense (PROFECO, 2009). Al igual que para otros tipos de alimentos la política de ”cero tolerancia” para Listeria spp. es aplicable a la espinaca precocida y congelada. La Figura 2 muestra la producción anual de espinaca en México (19972006).

22

30,000.00 25,000.00 TON

20,000.00 15,000.00 10,000.00 5,000.00 0.00 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 AÑO

Figura 2. Produccion anual de espinaca en México. Fuente: Anuario Estadístico de la Producción Agrícola SAGARPA, 2008.

2.9 Planteamiento del problema.

Una empresa que procesa espinaca precocida y congelada presentó problemas de contaminación con L. monocytogenes en el producto terminado. Con la finalidad de aplicar sistemas dirigidos al aseguramiento de la inocuidad de este alimento, en un trabajo realizado previamente por Esquivel (2009) se generó información que condujo a conocer las fuentes de contaminación que estaban operando en la empresa. Para lograrlo se obtuvo información acerca de la incidencia de L. monocytogenes durante la producción en la planta mediante la recolección y análisis de 428 muestras de las diferentes áreas de proceso, incluyendo espinaca, superficies, equipo y agua. Las cepas de L. monocytogenes

aisladas

fueron

tipificadas

molecularmente

mediante

electroforesis en gel por campos pulsados (EGCP) siguiendo el protocolo del Pulse Net (CDC, 2004) con algunas modificaciones. Posteriormente se evaluaron varios tratamientos de desinfección empleados en la inactivación de L. monocytogenes en espinacas crudas. Se evaluaron: hipoclorito de sodio (200 ppm,

Clorox®), dióxido de cloro (5 ppm, Vibrex Horticare®), ácido

peracético (80 ppm, Ecolab®), plata coloidal (1.4 ppm, Microdyn®) y metabisulfito de sodio (50000 ppm, Sigma México). 23

En esa serie de experimentos se utilizaron espinacas inoculadas con dos diferentes mezclas de cepas de orígenes distintos. Se empleó una mezcla de cepas de colección (V7, Scott A, 101-M, 101-14 y LCDC) y una mezcla de cepas aisladas de la planta (F6, F15, F16, F26 y L75). Las cepas de colección inoculadas en las espinacas mostraron reducciones de 3.2 y 4.0 log UFC/espinaca después de haber sido expuestas a hipoclorito de sodio y ácido peracético, respectivamente. En contraste, la mezcla de las cepas aisladas de la planta mostró reducciones menores: 1.65 y 2.11 log UFC/espinaca después del contacto con hipoclorito de sodio y ácido peracético, respectivamente (Esquivel, 2009). Los resultados observados para el resto del los germicidas estudiados fueron similares para ambas mezclas de L. monocytogenes estudiadas.

Este hallazgo, llevó a plantear la hipótesis de que las cepas de L. monocytogenes dentro de la planta procesadora donde se encuentran expuestas continuamente a concentraciones subletales de los germicidas de uso común (ácido peracético e hipoclorito de sodio) en esa industria. De tal forma que las bacterias pueden generar mecanismos de resistencia a dichos compuestos, logrando sobrevivir a los tratamientos de desinfección química actualmente utilizados. Situación que incrementa el riesgo de enfermar por parte del consumidor, ya que pueden llegar a estar presentes microorganismos patógenos en los alimentos aún después de aplicar los tratamientos germicidas. La caracterización de los mecanismos por los cuales las bacterias adquieren resistencia a los desinfectantes químicos generará información que contribuya a diseñar e implementar estrategias adecuadas de desinfección química.

24

III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Caracterizar fenotípicamente la resistencia a germicidas en cepas de L. monocytogenes aisladas de espinacas y diversas áreas en una planta procesadora de espinaca precocida y congelada.

3.2 Objetivos específicos

1. Seleccionar cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a hipoclorito de sodio y ácido peracético.

2. Inducir de la resistencia a cloro en cepas de L. monocytogenes seleccionadas.

3. Evaluar la capacidad de las cepas de L. monocytogenes seleccionadas para producir biopelículas en acero inoxidable y polipropileno.

25

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Material biológico

Cepas. Se utilizaron cinco cepas de L. monocytogenes aisladas de un proceso de producción de espinaca precocida y congelada (F6, L15, L18, L26, L75) y cinco cepas de L. monocytogenes de colección (Scott A, V7, 101-M, LCDC, 101-14) del cepario del laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos del Posgrado en Alimentos de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro.

En todas las cepas se seleccionaron las células resistentes a rifampicina (Sanofis Aventis de México, S.A. de C.V.) por el método señalado por Kaspar y Tamplin (1993). Para la conservación de los cultivos se utilizó caldo soya tripticaseína adicionado de glicerol al 15% (Bioxon, Becton Dickinson, México) a -18ºC.

Espinacas. Las espinacas fueron adquiridas en centros comerciales de la ciudad de Querétaro. Se seleccionaron aquellas que no presentaron daño mecánico. Previo a la aplicación de los tratamientos de desinfección, se realizó un enjuague bajo el chorro de agua potable; una vez lavadas se cortaron en cuadros utilizando una plantilla de plástico de 5 x 5 cm.

4.2 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a hipoclorito de sodio y ácido peracético

4.2.1 Preparación del inóculo

La activación de cada cepa se realizó transfiriendo 10 µl de los viales que se mantuvieron en congelación a un tubo con 3 ml de caldo soya tripticaseína (CST, Bioxon), fueron incubados a 35ºC/24h. A partir de estos cultivos se realizó una segunda transferencia a CST y los tubos se incubaron a 35ºC/18h; finalmente se cosecharon las células por centrifugación (3500 rpm, 10 min, 22ºC). Los paquetes celulares se lavaron y se resuspendieron en 26

solución salina isotónica estéril (SSI, 0.85%), se centrifugaron nuevamente (3500 rpm, 10 min, 22ºC), para finalmente resuspender las células en agua destilada estéril (vehículo).

El recuento de las células que contenía cada suspensión celular (inóculo) se realizó en agar soya tripticaseína suplementado con rifampicina (200 mg/L) y pimaricina (100 mg/L) (ASTRP) empleando la técnica de extensión en superficie. Las placas se incubaran a 35ºC /48h.

4.2.2 Inoculación de cuadros de espinaca

Los cuadros de espinaca se inocularon por separado con 100 µl (aproximadamente 10 gotas de 10µL cada una) de la suspensión de cada una de las cepas de L. monocytogenes (4.1), distribuidas en la superficie del cuadro de espinaca. La cantidad final de células por cuadro de espinaca fue de aproximadamente 1 x 108 UFC. Una vez inoculadas, se secaron durante 45 min/22 ± 2ºC en campana de flujo laminar.

4.2.3 Preparación de las soluciones desinfectantes

El día en el que se realizó el experimento se prepararon soluciones desinfectantes de ácido peracético (80 ppm, Ecolab®) e hipoclorito de sodio (200 ppm, Cloralex®); a esta ultima solución se le ajustó el pH a 6.5 ± 0.5 adicionando solución de ácido clorhidrico (20%, J. T. Baker). La concentración de la solución de hipoclorito de sodio (cloro) se verificó por el método yodométrico (Anexo 1, Greenberg et al., 1992) y la del ácido peracético por el método reportado por Greenspan y Mackellar (1948) metodología descrita en el Anexo 2. Finalmente las soluciones desinfectantes se distribuyeron (50 ml) en en bolsas de polietileno (17.8 x 23.3 cm).

4.2.4 Aplicación de los tratamientos de desinfección

Las muestras de espinaca inoculadas y secadas fueron sumergidas durante cinco minutos sin agitación de forma individual en cada una de las 27

soluciones germicidas (4.2.3) y agua destilada estéril (control de arrastre mecánico).

4.2.5 Recuento de microorganismos sobrevivientes a los tratamientos de desinfección

Transcurrido el tiempo de contacto para cada tratamiento, las muestras (espinacas) fueron transferidas a caldo neutralizante (D/E, DifcoTM) y colocadas en un homogenizador mecánico (Bag Mixer® 400, Interscience) durante 1 minuto. De la suspensión obtenida se prepararon diluciones decimales en diluyente de peptona estéril (0.01%) para realizar el recuento de los microorganismos viables mediante extensión en superficie en ASTRP. Finalmente las placas fueron incubadas a 35 ± 2ºC durante 48 h. En la Figura 3 se muestra la metodología para el recuento de microorganismos sobrevivientes a los tratamientos de desinfección.

4.2.6 Análisis estadístico

El diseño experimental empleado fue un factorial completamente al azar donde los factores estudiados fueron tipo de cepa (F6, L15, L18, L26, L75, Scott A, V7, 101-M, LCDC, 101-14) y la solución desinfectante (hipoclorito de sodio, ácido peracético y agua como control de arrastre). De cada experimento se realizaron tres replicas cada una con tres repeticiones. Se realizó un análisis de varianza y comparación de medias mediante prueba de Tukey utilizando el paquete estadístico J.M.P. versión 5.0.1.

28

Suspensión L. moncytogenes Espinacas lavadas Inoculación con 10 gotas (10µl c/u)

Ctrl. Inóculo espinaca t' 0

Cuadros 5 x 5 cm Resuspender H2O

Secar/45 min

Sumergir

Cloro (50 ml)

Sumergir

Lavar SSI (0.85%)

Ctrl. Secado

Sumergir

Ac. Peracético (50 ml)

H2O (50 ml)

5 min Neutralizar 50 ml Caldo D/E Homogenizar/1 min

Diluciones

Inocular ASTRP Incubar 2448hrs/35oC

Reportar UFC/cuadro de espinaca

Figura 3. Evaluación de los tratamientos de desinfección química en espinaca inoculada con L. monocytogenes

29

4.3 Inducción de la resistencia a cloro en cepas de L. monocytogenes seleccionadas

4.3.1. Exposición consecutiva de las células de la cepa L15 a cloro en suspensión (buffer de fosfatos) Se utilizó una suspensión bacteriana de la cepa L15 (~1x109 UFC/ml) preparada siguiendo la metodología descrita (4.2.1) de esta suspensión bacteriana se transfirió de manera individual 1 ml a tres tubos con 9 ml de solución de cloro a concentraciones de 10, 20 y 40 ppm (preparado en buffer de fosfatos). El tiempo de contacto de las células con el germicida fue de 30, 60 y 90 seg. para cada concentración. Las concentraciones de las soluciones de cloro fueron verificadas como se describió en el apartado 4.2.3.

Transcurridos los tiempos de exposición de las células con las soluciones de cloro, se agregó 1 ml de solución de tiosulfato de sodio (0.5%, KEM MR) a cada tubo y se homogenizaron en vortex. De la suspensión obtenida se realizaron diluciones decimales en diluyente de peptona estéril (0.01%). El recuento de los microorganismos viables se realizó mediante la técnica de extensión en superficie utilizando ASTRP. Las placas se incubaron a 35 ± 2ºC durante 48 h. Paralelamente, de la misma suspensión una vez neutralizada se transfirieron 10 µl a caldo soya tripticaseína (3 ml), estos tubos se incubaron a 35ºC de 24 a 38 horas hasta obtener una absorbancia de 0.50 a 0.55 nm (concentración bacteriana ~ 1x109 UFC/ml). La metodología descrita se repitió de forma consecutiva por cinco ocasiones.

4.3.2. Exposición consecutiva a cloro de células de L. monocytogenes inoculadas en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber

Se emplearon cuadros de espinaca (5 x 5 cm), cuadros de de N-rubber (5 x 5 cm) y cuadros de acero inoxidable (2 x 2 cm). Los materiales inertes se lavaron con detergente, se enjuagaron perfectamente con agua potable, seguido de un enjuague con etanol (70%) y agua destilada para finalmente ser esterilizados en autoclave (121ºC, 15 lb, 15 min.); los cuadros de espinaca 30

fueron preparados siguiendo la metodología descrita (4.1). Posteriormente los tres materiales se inocularon con la suspensión bacteriana de la cepa L15, seguida de la técnica descrita en el apartado 4.2.2. Se prepararon soluciones de hipoclorito de sodio a concentraciones de 20 y 200 ppm (verificando su concentración siguiendo la metodología descrita en el apartado 4.2.3).

Los cuadros de espinaca se sumergieron en 50 ml de cloro (200 ppm) durante 5 minutos y los cuadros de acero inoxidable y n-rubber fueron sumergidos en 50 ml de cloro (20 ppm) durante 1 minuto. Transcurridos los tiempos de contacto todos los cuadros fueron transferidos a caldo D/E (50 ml), para efectuar el recuento de los sobrevivientes (4.2.5).

De las placas de ASTRP donde se realizó el recuento de células viables se picó una colonia y se inoculó en un tubo con CST (3 ml) el cual fue incubado a 35ºC durante 24 a 30 horas (hasta obtener una D.O. de 0.5 a 0.55 nm). El procedimiento completo de exposición a cloro, neutralización y transferencia de las celulas expuestas al germicida para cada uno de los materiales se repitió en seis ocasiones, en cada pase se realizó el recuento de células viables.

4.3.2.1 Comportamiento de células de L. monocytogenes en CST expuestas consecutivamente a cloro

Las células de L. monocytogenes que se recuperaron a partir de espinaca después de dos exposiciones consecutivas y de acero inoxidable y nrubber después de seis exposiciones consecutivas, fueron lavadas con SSI. Se inocularon microplacas con las células resuspendidas en CST (300 µl para cada fosa) a dos concentraciones (2 y 6 UFC/ml); los cambios en la densidad óptica de las muestras fueron medidas en el equipo automatizado BIOSCREEN C de forma individual. Con el propósito de conocer si las células que habían sido expuestas de manera consecutiva a cloro adquirían cierta resistencia, simultáneamente estas células fueron expuestas a cloro (~10 ppm) en CST. Los registros de las dinámicas se realizaron durante 45 horas bajo las siguientes condiciones: 35ºC, con lecturas cada 30 min. y agitación durante 5 31

segundos previo a la lectura la cual fue medida a una longitud de onda de 0.6 nm.

4.3.3

Exposición

de

las

células

de

L.

monocytogenes

a

bajas

concentraciones de cloro durante tiempos prolongados

4.3.3.1 Preparación del inóculo

Se utilizaron las cepas L15 y la Scott A, que resultaron ser la más resistente y la más sensible, respectivamente. Las suspensiones bacterianas fueron preparadas como se indicó en el apartado 4.2.1.

4.3.3.2 Preparación de medio Evans modificado

Los experimentos correspondientes al apartado 4.3.3 fueron realizados en medio Evans modificado. En el Cuadro 4 se indican las cantidades de cada reactivo necesarias para preparar un litro de medio, estas fueron basadas en lo reportado por Evans (1970) con algunas algunas modificaciones.

Cuadro 4. Composición del medio Evans modificado Reactivo

Cantidad

Marca

NaH2PO4.2H2O

312 mg

J.T. Baker, México

K2HPO4.3H2O

2.28 g

J.T. Baker, México

NH4Cl

2.14 g

J.T. Baker, México

KCl

298 mg

J.T. Baker, México

Na2SO4

113 mg

J.T. Baker, México

ZnO

816 µg

J.T. Baker, México

MgCl2.6H2O

35.6 mg

J.T. Baker, México

CaCl2.2H2O

1.18 mg

Merck México, S.A.

Na2EDTA.2H2O

29.3mg

J.T. Baker, México

Na2MoO4.2H2O

9.7 µg

KEM MR

FeCl3.6H2O

10.8 mg

J.T. Baker, México

32

MnCl2.4H2O

4 mg

J.T. Baker, México

CuCl2.2H2O

340 µg

J.T. Baker, México

CoCl2.6H2O

952 µg

J.T. Baker, México

H3BO3

124 µg

Fisher Scientific, U.S.A.

Acetato (0.15%

1.5 g

J.T. Baker, México

como acetato de sódio) fuente de carbono Fuente: Evans et al., 1970. Las sales fueron colocadas en un matraz el cual se aforó a un litro con agua destilada, posteriormente esta suspensión fue mezclada con agitación durante 2 horas a 22 ± 2ºC, seguida de zonicación a 60 setsonics/min a 22 ± 2ºC durante 3 horas (zonicador Branson 3510). Finalmente el pH se ajustó a 7.15 ± 0.2 y se esterilizó a 121ºC durante 15 min a 15 lb.

4.3.3.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio Evans modificado Empleando una suspensión bacteriana con una concentración de 1x105 UFC/ml, se transfirió una alícuota a medio Evans modificado a tres diferentes concentraciones completo (descrito anteriormente en el Cuadro 3), diluido en agua destilada a la mitad y diluido diez veces. La concentración final de bacterias en los tres medios fue de ~1x103 UFC/ml. Estas muestras fueron incubadas a 22 y 30 ± 2ºC durante 48 horas con agitación a 120 rpm. De cada una se realizaron recuentos microbianos a las 0, 6, 12, 24, 30, 36 y 48 horas de incubación; las muestras fueron diluidas en diluyente de peptona estéril (0.01%) e inoculadas en ASTRP mediante la técnica de extensión. Las placas se incubaron a 35 ± 2ºC durante 48 h.

4.3.3.4 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en medio Evans modificado

Medio Evans modificado diluido al 50% con solución de hipoclorito de sodio (~3 ppm) fue inoculado con la cepa L15 y Scott A (~1x1010 UFC/ml) cada 33

una de forma independiente, obteniendo una concentración final para cada muestra de ~1x108 UFC/ml y 1.5 ppm de cloro. Ambas muestras (cepa L15 y Scott A) fueron incubadas a 22 ± 2ºC y 30 ± 2ºC durante 150 min. Periódicamente, se tomaron alicuotas para efectuar el recuento de células viables a los 0, 20, 40, 60, 90 y 150 minutos de incubación siguiendo la metodología descrita en el apartado (4.3.3.3).

De estas muestras de forma paralela transcurridos 150 minutos de incubación se tomaron alícuotas de 10 ml (células sobrevivientes) de los frascos inoculados con la cepa L15 y Scott A que fueron incubados a 30 ± 2ºC. A cada una de estas alícuotas se les agregó 100 µl de tiosulfato de sodio (0.5%, KEMMR).

4.3.3.5 Detección de ADN plasmídico en las cepas seleccionadas

Las muestras de L. monocytogenes (cepas L15 y Scott A) obtenidas siguiendo la metodología descrita en el apartado 4.3.3.4 fueron centrifugadas durante 15 minutos a 3500 rpm a 22 ± 2ºC y el paquete celular se resuspendió en 10 ml de SSI estéril; este procedimiento se repitió en dos ocasiones, está suspensión fue centrifugada (5,000 rpm, 5 min., 22ºC) y posteriormente al sedimento se le adicionó 50 µl de lisozima (5%, Quiagen). Las muestras obtenidas hasta este paso fueron tratadas siguiendo la metodología de lisis alcalina para la extracción de ADN plásmidico como se describe en el Anexo 3.

Para correr la muestra se utilizó un gel de agarosa a 0.3% (ultra-pure Invitrogen, U.K), el se colocó en una cámara de electroforesis (Bio-Rad), las muestras se mezclaron con el buffer de carga (1X TAE) y se colocaron en los carriles de carga, posteriormente el gel fue cubierto con buffer (Invitrogen) al cual se le aplicó un voltaje de 60 volts (Bio-Rad) durante 25 minutos. El gel fue revelado en solución de bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las imágenes de los geles se obtuvieron con Fotodocumentador BIO-RAD (Universal Hood II, V~50/60Hz-200VA, modo UV) analizado con el programa Quantity-One.

34

4.3.3.6 Observación de células de L. monocytogenes expuestas a cloro mediante el microscopio electrónico de transmisión

De los matraces que contenian medio Evans modificado inoculado con la cepa L15 (4.3.3.4) se tomaron alícuotas (15 ml) después de 20 y 120 minutos de incubación a 30 ± 2ºC. Las alícuotas se colocaron en tubos Falcón y el cloro fue neutralizado adicionando 100 µl de tiosulfato de sodio (0.5%, KEMMR). Se homogenizaron y centrífugaron (3,500 rpm, 22 ± 2ºC, 10 min), los paquetes celulares fueron conservados a 18ºC durante 4 h, a éstos se les adicionó 1 ml de glutaraldehído (3%) durante 48 h a 22 ± 2ºC. Se retiró el glutaraldehído se enjuagó en dos ocasiones, con 1 ml de buffer de cacodilato de sodio (0.2 M, pH 7.4), se añadió 1 ml de tetraóxido de osmio (1%, pH 7.4) manteniendo las muestras sumergidas en hielo (a 4ºC durante 2 horas). La concentración del glutaraldehído y el tetraóxido de osmio utilizados se ajustaron a 3 y 1% respectivamente, utilizando solución amortiguadora de cacodilato de sodio (0.1 M pH 7.4). Una vez que las células fueron fijadas y postfijadas, se deshidrataron sumergiéndolas en etanol con gradientes de concentración creciente (de 0 a 100%) a 4ºC. Posteriormente las células fueron secadas en un desecador de punto crítico y atrapadas en resina epóxica (polybed EMbed 812: epón 812, ddsa: anhídrido dodecenil succinico, nma: anhídrido metil nadico, bdma: catalizado benzil dimetil amina) las muestras inmersas en está se cortaron con un ultramicrótomo (MT-X, RMC) obteniendo rebanadas con un grosor de 60 nm. Posteriormente estas fueron montadas sobre porta-muestras de cobre (círculos de 0.3 cm de diámetro), que a su vez se colocó en una rejilla y se observaron en el microscopio electrónico de transmisión (JEOL, modelo JEM-1010) el cual trabaja en un rango de 60-80 Kv con resolución de 0.25 nm aproximadamente. Las muestras de los tratamientos fueron observadas y comparadas con un control negativo (células que no fueron expuestas a ningún germicida cultivadas en caldo soya tripicaseína).

35

4.4 Evaluación de la capacidad de las cepas de L. monocytogenes seleccionadas

para

producir

biopelículas

en

acero

inoxidable

y

polipropileno

4.4.1 Preparación del inóculo

Las cepas empleadas fueron L15 y Scott A de las cuales se utilizaron suspensiones obtenidas siguiendo la metodología descrita anteriormente (4.2.1) con la variante de que las temperaturas de incubacion para la activación del inóculo en el medio (CST) fue 22 y 30ºC las cuales corresponden a las temperaturas empleadas para inducir la formación de biopeliculas.

4.4.2 Preparación de los materiales inertes

Se utilizaron círculos (1.2 cm de diámetro) de acero inoxidable (Cal. 20, 304 Grado Alimenticio) y polipropileno (PPBB65-P1-L90) se lavaron con solución de detergente, seguido de enjuague a chorro de agua potable posteriormente fueron sumergidos en etanol (70%) y enjuagados con agua destilada, secados y esterilizados en autoclave a 121ºC, 15 lb durante 15 minutos.

4.4.3 Inoculación del medio Evans modificado

Matraces con medio Evans modificado adicionado de cloro (150 ml de medio Evans y 147 ml de solución de hipoclorito de sodio, ~3 ppm) y sin cloro (150 ml de medio Evans modificado y 147 ml de agua destilada) de forma independiente se inocularon con 3 ml de la suspensión bacteriana de la cepa L15 o Scott A (1x1010 UFC/ml). La concentración final para cada muestra fue de aproximadamente de 1x108 UFC/ml.

4.4.4 Inducción de la formación de biopelículas

A cada matraz con Medio Evans (con y sin cloro) se introdujeron cuatro círculos de cada material (acero inoxidable y polipropileno) posteriormente se 36

incubaron con agitación (120 rpm) a 22 ó 30 ± 2ºC durante 150 min. De las suspensiones contenidas en cada uno de los frascos se realizó el recuento de células viables a los 0 y 150 min de incubación. Alícuotas (1 ml) fueron transferidas a tubos que contenían 9 ml de caldo neutralizante (D/E Difco TM) de esta suspensión se realizó recuento de células viables siguiendo la técnica de extensión en superfice en ASTRP, las placas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Paralelamente a los recuentos en el medio Evans modificado, también se estimó la población adherida a las superficies de acero inoxidable y polipropileno. Para ello se retiraron círculos (acero inoxidable y polipropileno) del medio Evans modificado a los 0 y 150 minutos de incubación. Estos fueron lavados en tres ocasiones con agua destilada estéril con la finalidad de únicamente realizar recuento de las células adheridas. Posteriormente cada círculo se colocó en 5 ml de caldo neutralizante (D/E Difco

TM

) y se

homogenizaron durante 2 minutos (Bag Mixer® 400, Interscience). A partir de esta suspensión se realizó el recuento de las células viables siguiendo la técnica de extensión en superficie en ASTRP.

4.4.5 Observación de la superficie de los materiales inertes mediante microscopio electrónico de barrido

Transcurridos 150 minutos de incubación de las muestras descritas en el apartado (4.4.4) se removieron los círculos que estuvieron inmersos en medio Evans con y sin hipoclorito de sodio y se enjuagaron en tres ocasiones con agua destilada estéril. Los círculos se secaron a 37ºC durante 2 horas y se sumergieron en solución de glutaraldehído (3%) durante 2 h a 18ºC, se enjuagaron con solución de buffer de cacodilato de sodio (0.2 M, pH 7.4), seguida de postfijación en solución de tetraóxido de osmio (1%, pH 7.4) a 4ºC durante 2 horas. Se enjuagaron por inmersión en solución de buffer de cacodilato de sodio, se deshidrataron sumergiéndolas en soluciones de etanol a concentraciones crecientes (de 0 a 100%) y se desecaron en un desecador de punto crítico (Polaron E5000). Para la observación mediante microscopio electrónico de barrido (Digital Scanning Microscope DSM 950, ZElZZ, West Germany) los círculos fueron montados en portamuestras, recubiertos con carbón y aerosoles de oro ionizado. 37

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a cloro y ácido peracético Encuestas realizadas en frutas y verduras crudas demuestran que una amplia variedad de estos productos son susceptibles de contaminación con microorganismos, incluyendo patógenos a humanos. Las frutas y verduras listas para consumo contaminadas con patógenos que provengan del medio ambiente, de materia fecal de animales o humana, pueden causar enfermedad. Como no es posible evitar la contaminación en este tipo de productos, una medida alternativa para disminuir los riesgos a la salud asociados a su consumo es el lavado y desinfección (NACMCF, 1999). Existen en la literatura innumerables reportes de estudios en donde se ha evaluado la eficacia de los compuestos químicos que comúnmente se utilizan en los hogares y a nivel industrial para desinfectar frutas y verduras (Beuchat et al., 1998). Sin embargo, aún no existe un método estándar de prueba para llevar a cabo dicha evaluación. Recientemente se han desarrollado protocolos encaminados a establecer un método confiable que permita evaluar la efectividad de los germicidas. El método de desinfección que aplicamos en nuestro trabajo está basado en una serie de estudios realizados en nuestro laboratorio y es afín a los esquemas de evaluación propuestos en la literatura (Beuchat et al., 2001; Harris et al., 2001). Como se mencionó en el apartado de antecedentes, este trabajo tuvo como precedente una investigación realizada dentro de una empresa en donde se llevó a cabo el aislamiento de 63 cepas de L. monocytogenes a partir de espinacas y de la superficie de diversos materiales dentro de una planta procesadora de espinaca precocida y congelada. En ese trabajo se observó que al comparar la eficacia de diversos germicidas (entre ellos el cloro y el ácido peracético) para la inactivación de L. monocytogenes en la superficie de hojas de espinaca, las cepas que se aislaron de la empresa mostraron una mayor resistencia a los tratamientos de desinfección en comparación con cepas de colección (Esquivel, 2009). 38

En nuestra investigación a diferencia la realizada por Esquivel (2009), la susceptibilidad a cloro y al ácido peracético se evaluó de forma independiente en cada una de las cinco cepas aisladas del proceso de producción. Se utilizaron como control, cepas de L. monocytogenes de colección que teóricamente no habían sido expuestas a los germicidas. Se ha reportado

que

las

condiciones

ambientales

previas

a

las

que

los

microorganismos hallan sido expuestos influye en la resistencia ante los tratamientos de erradicación microbiana como la desinfección química, ya que los que han sido expuestos a alguna condición estresante logran sobrevivir en mayor proporción en comparación con aquellas células que no han sido expuestas a condiciones que les genere estrés (Sapers, 2001).

Las variaciones en los resultados obtenidos en las desinfecciones de verduras y frutas pueden deberse a la composición y la estructura de las hojas estas presentan estomas, lenticelas, tricomas y quizá daños algunos mecánicos en su superficie no detectables a simple vista, todos sitios donde los microorganismos pueden penetrar quedar protegidos del efecto de los agentes germicidas y cada espinaca es una unidad experimental que presenta diferencias con las otras espinacas utilizadas (Burnett y Beuchat, 2001; Beuchat, 2002).

En la Figura 4 se muestran las medias de reducción global para los tres tratamientos aplicados en cada una de las cepas probadas.

39

2.4

LOG DE UFC/ESPINACA

2.2

a

a

2

a a

1.8

a

1.6

a

a

a

1.4

a a

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Scott A

101-M

LCDC

F6

V7

L75

101-14

L26

L18

L15

CEPAS

Figura 4. Reducción global en las poblaciones de L. monocytogenes en espinaca por efecto de la desinfección con cloro y ácido peracético.

Los valores de las reducciones microbianas para las diferentes cepas probadas no mostraron diferencia estadística significativa entre ellas, con una diferencia en los valores de reducción entre la cepa Scott A y L15 de 0.81 log de UFC, la amplia variabilidad en los resultados no permite que el análisis de varianza indique que entre estas talvéz si exista diferencia significativa en su resistencia a los germicidas probados; la cepa que mostró mayor reducción fue la Scott A la cual no ha tenido contacto previo con germicidas ni se ha expuesto a otro tipo de factor estresante comparada con la cepa L15 la cual fue aislada de restos de espinaca que se encontraban en el piso de la planta (Esquivel, 2009); sitio donde es común encontrar restos de germicidas los cuales no contienen la concentración suficiente para lograr la inactivación de los microorganismos. Adicionalmente los restos de espinaca pueden permanecer en el piso durante varios días en donde los microorganismos se encuentran en condición de estrés el cual les provoca daño subletal, la exposición de las bacterias a germicidas a concentraciones subletales puede inducir el incremento de la resistencia microbiana a estos agentes (Mereghetti et al., 2000). Se ha sugerido que tanto el uso de germicidas químicos como el de antibióticos deben ser utilizados a los tiempos y a las concentraciones recomendadas, para evitar la adaptación bacteriana.

40

Los mecanismos de adapatación que generan los microorganismos ante condiciones adversas en nuestros días han sido poco caracterízados. Heir et al. (1998) y Aase et al. (2000) propusieron que la resistencia que expresan los microorganismos a germicidas químicos es causada por la activación de mecanismos internos de expulsión que evitan el paso de sustancias tóxicas al interior de las células o bien eliminándolas de su interior. Este mecanismo se ha demostrado en algunas cepas de L. monocytogenes expuestas a cloruro de benzalconio (Heir et al., 1998; Aase et al., 2000).

Mereghetti et al. (2000) reportaron que cepas de L. monocytogenes mostraron resistencia a QACs (sales cuaternarias de amonio) a los que se exponían constantemente; en estas cepas no se detectó la presencia de plásmidos, por lo que su resistencia fue atribuida a sus características innatas.

Sapers (2001) reportó que los métodos actuales de lavado y desinfección, no logran reducir la carga microbiana en más de 2 log por tal motivo es necesario comprender los mecanismos por los cuales las bacterias lograr sobrevivir a los tratamientos de desinfección actualmente utilizados, con la finalidad de mejorar su eficacia y de esta forma reducir el riesgo de enfermar por el consumo de alimentos minimamente procesados.

Beuchat et al. (2005) obtuvieron reducciones microbianas mayores en hojas de lechuga completas comparadas a las obtenidas en hojas picadas empleando cloro, esto fue quizá porque al realizar el corte, los microorganimos pueden adherirse a los bordes y evitar el contacto con el germicida; o bien la liberación de fluidos (materia orgánica) que reaccionan con el cloro neutralizándolo.

Zhang y Farber (1996) evaluaron el efecto de los germicidas cloro (200 ppm, 10 min.), dióxido de cloro (5 ppm, 10 min.) y fosfato trisodico (SalmideR, 200 ppm, 10 min.) en lechuga y col inoculadas con L. monocytogenes. Las máximas reducciones al aplicar cloro a 4 y 22ºC fueron de 1.3 y 1.7 log para lechuga y 0.9 y 1.2 log para col, respectivamente. El dióxido de cloro a 4 y 22ºC redujo 1.1 y 0.8 log UFC en lechuga, y 0.4 y 0.8 log UFC en col, 41

respectivamente mientras que SalmideR a 22ºC redujo 1.8 y 0.6 log UFC en lechuga y col, respectivamente. En nuestro estudio se obtuvieron reducciones con valores cercanos al utilizar hipoclorito de sodio (200 ppm, 5 min.) en espinacas inoculadas con L. monocytogenes.

El Cuadro 5 muestra el análisis de varianza, el efecto de cada uno de los factores (cepa y desinfectante) asi como su interacción en las reducciones microbianas obtenidas en cada tratamiento. El tipo de cepa así como el tipo de desinfectante tienen efecto significativo en las reducciones obtenidas siendo el tipo de desinfectantes el factor de mayor importancia en las reducciones obtenidas (p= 6.65 > 6.80 > 6.79 > 6.79 90

20

30 60 90

4.80 5.54 6.37

4.32 5.61 6.40

4.61 5.92 > 6.80

4.76 5.98 > 6.79

> 6.79 > 6.79 > 6.79

40

30 60 90

4.42 6.95 > 6.85

6.04 6.71 > 6.65

4.68 5.72 > 6.80

> 6.79 > 6.79 > 6.79

> 6.79 > 6.79 > 6.79

La exposición consecutiva de las células de la cepa L15 a cloro en suspensión aparentemente no ocasionó incremento en la resistencia. To et al. (2002) en un estudio similar obtuvieron un incremento en la tolerancia de células de L. monocytogenes expuestas a cloruro de benzalconio de forma gradual al exponer durante una semana las células del patógeno a concentraciones crecientes del germicida; en la décima transferencia el patógeno expresó la mayor resistencia al germicida. La falta de la expresión de la resistencia en nuestros experimentos puede tener varias explicaciones: 1) el tiempo de contacto de las celulas de L. monocytogenes con el germicida no fue suficiente para propiciar el incremento en la resistencia, 2) durante los pases de las células a caldo y agar las células dejaron de estar en contacto con el agente estresante (cloro) propiciando que las celulas cancelaran el mecanismo de defensa ante el agente estresante. Esta situación llevó al planteamiento de una nueva estrategia: aumentar el tiempo de contacto de las células con el germicida y reducir la concentración. .

45

5.2.1 Exposición consecutiva a cloro en células de L. monocytogenes inoculadas en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber

En el Cuadro 7 se muestran los resultados obtenidos después de aplicar tratamientos con cloro en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber inoculados con L. monocytogenes. Al igual que en la suspensión de buffer de fosfatos no se observó un incremento en la resistencia de las células al germicida. Al sexto dia de transferencia de las células unicamente recuperamos sobrevivientes de los tratamientos que fueron realizados en la superficie de acero y N-rubber. Esto quizá pudo ser ocasionado por la concentración del germicida ya que para estos materiales fue menor que la utilizada en los tratamientos realizados en espinaca.

Cuadro 7. Reducción en la población de L. monocytogenes en materiales inertes y espinaca por efecto de la exposición consecutiva a cloro. Material Acero

N-rubber

Espinaca

Concentración (ppm)

Tiempo (min)

Réplica

20

1

20

Día 1

2

3

4

5

6

1

3.67

>7.30

>7.30

>7.30

>7.30

>7.30

1

2

3.53

3.23

2.28

1.93

3.49

3.13

20

1

3

2.91

>7.30

>7.30

>7.30

>7.30

>7.30

20

1

1

4.11

2.40

3.11

3.21

3.51

3.75

20

1

2

4.76

2.67

3.12

3.06

4.16

3.19

20

1

3

3.60

3.16

2.39

2.74

4.33

3.47

200

5

1

1.56

4.68

1.31

>7.30

>7.30

>7.30

200

5

2

1.89

4.31

2.42

>7.30

>7.30

>7.30

200

5

3

2.34

4.40

2.44

>7.30

>7.30

>7.30

46

5.2.2 Comportamiento de células de L. monocytogenes en CST expuestas consecutivamente a cloro

Con la finalidad de conocer si el comportamiento de las células de L. monocytogenes (cepa L15) recuperadas después de las exposiciones consecutivas a cloro en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber, era diferente, se efectuaron mediciones de los cambios en la densidad óptica (D.O.) utilizando el equipo computarizado Bioscreen C (Figura 6).

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

Tiempo (horas) 2 UFC/ml

2 UC/ml Cloro

6 UFC/ml Cloro

2 UFC/ml

C

20

17

18.5

14

15.5

11

2 UFC/ml Cloro

6 UFC/ml Cloro

D

N-RUBBER

0.7

ACERO

0.6

0.3

Tiempo (horas) 2 UFC/ml

2 UFC/ml Cloro

18.5

0

20

17

18.5

14

15.5

11

12.5

9.5

8

6

4.5

0 3

0 1.5

0.1 0

0.1

15.5

0.2

12.5

0.2

0.4

9.5

0.3

0.5

6

0.4

3

0.5

D.O. (nm)

D.O. (nm)

12.5

Tiempo (horas)

0.7 0.6

8

0

20

17

18.5

14

15.5

11

12.5

8

9.5

6

3

0 4.5

0 0

0.1 1.5

0.1

9.5

0.2

3

0.2

0.3

4.5

0.3

0.4

1.5

0.4

B

ESPINACA

6

A

CONTROL

D.O. (nm)

D.O. (nm)

0.7

Tiempo (horas) 2 UFC/ml

6 UFC/ml Cloro

2 UFC/ml Cloro

6UFC/ml Cloro

Figura 6. Comportamiento de L. monocytogenes en CST a 35ºC. A) células no expuestas a cloro; B) células recuperadas despúes de tres exposiciones consecutivas a cloro en la superficie de espinaca; C) células recuperadas despúes de seis exposiciones consecutivas a cloro en la superficie de acero; D) células recuperadas despúes de seis exposiciones consecutivas a cloro en la superficie de N-rubber. 47

En estos experimentos se utilizaron dos niveles de inóculo (bajo 2 UFC/ml y alto 6 UFC/ml) en ambos se agrego cloro con el objetivo de comparar si las células que estuvieron previamente en contacto con el germicida (células recuperadas) mostraban cambios en la duración de cada fase de la curva de crecimiento. El comportamiento de las células previamente expuestas a cloro mostraron un comportamiento similar al de las células control (sin exposición previa al germicida), lo que puede indicar que en las células expuestas no hubo cambios importantes a nivel fisiológico.

5.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio Evans modificado La siguiente estrategia que se planteó para inducir resistencia a cloro en la cepa L15, fue exponer las células al germicida durante periodos de tiempo más prolongados a los probados en los experimentos previos. En esta estrategia se mantuvo a las células en contacto con el germicida evitando las transfrencias en caldo o medio de cultivo lo cual pudo haber interferido con la expresión de la resistencia. Para llevar a cabo lo anterior se disminuyó la concentración de cloro y se necesitó de un medio que no tuviera materia orgánica ya que esta reacciona con el cloro neutralizando su efecto germicida. En la literatura se ha reportado que un medio empleado para caracterizar proteínas que los microorganismos expresan cuando se encuentran en contacto con germicidas químicos es el medio Evans (Lupi et al., 1995). Así que para conocer si el medio Evans era adecuado para nuestros propósitos se efectuaron dinámicas de crecimiento. Se evaluaron tres concentraciones del medio Evans: preparado conforme lo reportado por Lupi et al. (1995), diluido 1:1 y 1:10 en agua, con el objetivo de conocer si la concentración tenia efecto en el desarrollo microbiano. La Figura 7 muestra el desarrollo de L. monocytogenes a 22 y 30ºC en el medio a las tres concentraciones estudiadas.

48

7

30ºC

6

5

Log UFC/ml

Log UFC/ml

7

22ºC

6

4 3 2

5 4 3 2 1

1

0

0 0

6

12 24 30 Tiempo (horas) ME

ME 1:1

36

0

48

6

12

24

30

36

48

Tiempo (horas)

ME 1:10

ME

ME 1:1

ME 1:10

Figura 7. Dinámicas de crecimiento de la cepa L15 en medio Evans modificado a tres diferentes concentraciones. -ME: medio completo; -ME: medio diluido al 50%; -ME: medio diluido 90%.

Se observa que el desarrollo de los microorganismos a 22ºC fue más lento en el medio no diluído comparado con el desarrollo microbiano en el medio diluido. Este comportamiento pudo ser ocasionado por la concentración de sales ya que estas pudieron ejercer estrés osmótico sobre las células disminuyendo su crecimiento. A 30ºC el desarrollo en el medio fue similar para las tres concentraciones probadas. Por lo anterior se decidió seguir utilizando el medio diluido 50% (en agua) para los experimentos sucesivos.

5.3.1 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en medio Evans modificado

Con el objetivo de conocer la resistencia de las cepas seleccionadas (más resistente L15 y más sensible Scott A) a hipoclorito de sodio a concentraciones relativamente bajas (~1.5 mg/L, preparado en medio Evans modificado) estas fueron expuestas al germicida durante 150 min. a 22 y 30°C (Figura 8).

49

Reducción (Log UFC/ml)

Reducción (Log UFC/ml)

8

8 7 6 5 4 3 2 1

6 5 4 3 2 1

0

0

0

20

40

60

90

150

Tiem po (m in)

0

20

40

60

90

Tiempo (min)

A

8

150

B

8 Reducción (Log UFC/ml)

Reducción (Log UFC/ml)

7

7 6 5 4 3 2 1 0

7 6 5 4 3 2 1 0

0

20

40

60

Tiem po (m in)

90

150

0

C

20

40

60

Tiem po (m in)

90

150

D

Figura 8. Comportamiento de las cepas de L. monocytogenes seleccionadas en medio Evans modificado adicionado de cloro. A) cepa L15, 22ºC; B) cepa Scott, 22ºC; C) cepa L15, 30ºC; D) cepa Scott A, 30ºC. Las células de la cepa L15 mostraron una reducción de 5.86 log UFC/ml después de 150 minutos de incubación a 22ºC mientras que la reducción obtenida después de 150 minutos a 22ºC de la cepa Scott A fue de 7.95 log UFC/ml; ambos resultados indican una tendencia a la inactivación en fución del tiempo lo que nos permite concluir que las células no estan expresado adaptación al germicida. Sin embargo el comportamiento de las células de la cepa L15 a 30ºC después de 150 minutos redujo en 3.70 log UFC/ml, mientras que para la cepa Scott A la reducción obtenida fue de 7.45 log UFC/ml. Estos resultados nos indican que la cepa L15 tiene una mayor capacidad de sobrevivir en presencia del germicida cuando este se encuentra a concentración subletal comparada con la cepa de colección Scott A. 50

En el Cuadro 8 se muestran los valores de los microorganismos sobrevivientes a la exposición a cloro de las cepas L15 y Scott A después de 150 minutos de incubación.

Cuadro 8. Células de las cepas Scott A y L15 sobrevivientes a la exposición a cloro Tiempo

Sobrevivientes (Log UFC/ ml)

(min.)

L15

Scott A

22ºC

30ºC

22ºC

30ºC

0

7.73

7.38

7.76

7.84

20

6.64

6.46

6.50

6.81

40

5.62

5.84

5.68

5.63

60

5.27

5.53

4.62

5.24

90

4.63

5.18